農(nóng)桿菌EHA103菌種RealTime PCR技術(shù)服務(wù)：

一、熒光定量PCR化學(xué)原理介紹　　

實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)即是在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程，*后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析的方法。PCR擴(kuò)增時(shí)在加入一對(duì)引物的同時(shí)加入一個(gè)特異性的熒光探針，該探針為一寡核苷酸，兩端分別標(biāo)記一個(gè)報(bào)告熒光基團(tuán)和一個(gè)淬滅熒光基團(tuán)。探針完整時(shí)，報(bào)告基團(tuán)發(fā)射的熒光信號(hào)被淬滅基團(tuán)吸收；PCR擴(kuò)增時(shí)，Taq酶的5'-3'外切酶活性將探針酶切降解，使報(bào)告熒光基團(tuán)和淬滅熒光基團(tuán)分離，從而熒光監(jiān)測(cè)系統(tǒng)可接收到熒光信號(hào)，即每擴(kuò)增一條DNA鏈，就有一個(gè)熒光分子形成，實(shí)現(xiàn)了熒光信號(hào)的累積與PCR產(chǎn)物形成完全同步。

二、農(nóng)桿菌EHA103菌種主要實(shí)驗(yàn)步驟

1、設(shè)計(jì)并合成Realtime PCR引物。

2、引物溶解后使用Promega的TaqDNA聚合酶進(jìn)行含SG（SYBR® Green）的PCR反應(yīng)的優(yōu)化。

3、 樣品RNA抽提   實(shí)驗(yàn)對(duì)象為組織樣品，取適量（50-100mg）新鮮組織樣品或正確保存的組織樣品加1ml的RNA抽提試劑Trizol（Invitrogen），勻漿后抽提RNA。

實(shí)驗(yàn)對(duì)象為細(xì)胞樣品，每份樣品取1×106～1×107細(xì)胞，PBS清洗細(xì)胞，去PBS加1ml的RNA抽提試劑Trizol（Invitrogen），裂解后抽提RNA

4、RNA質(zhì)量檢測(cè)

a. 農(nóng)桿菌EHA103菌種紫外吸收測(cè)定法測(cè)定RNA在分光光度計(jì)260nm和280nm處的吸收值，以計(jì)算其濃度并評(píng)估RNA純度

b. 使用ambion公司的甲醛電泳試劑進(jìn)行變性瓊脂糖凝膠電泳，檢測(cè)RNA純度及完整性。

5、使用逆轉(zhuǎn)錄酶（Promega）進(jìn)行反應(yīng)，將樣品RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。

6、 制備標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品：進(jìn)行相對(duì)定量，需要先將樣品的目的基因以及管家基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，其產(chǎn)物進(jìn)行梯度稀釋用于做標(biāo)準(zhǔn)曲線。

7、標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品和待測(cè)樣品分別加入到含SG的RealTime PCR反應(yīng)液中（其中TaqBeadTM熱啟動(dòng)聚合酶來自Promega公司），進(jìn)行RealTime PCR擴(kuò)增和檢測(cè)。

8、 農(nóng)桿菌EHA103菌種檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線分析：以對(duì)待測(cè)樣品的目的基因進(jìn)行定量。相對(duì)定量實(shí)驗(yàn)需要進(jìn)一步用樣品的目的基因測(cè)得值除以管家基因測(cè)得值以校正誤差，所得結(jié)果代表某樣品的目的基因相對(duì)含量。

9、提供實(shí)驗(yàn)報(bào)告：包括詳細(xì)的實(shí)驗(yàn)方法及實(shí)時(shí)熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果的相關(guān)圖表。

三、農(nóng)桿菌EHA103菌種樣本準(zhǔn)備

組織或細(xì)胞標(biāo)本